د کورونویرس نقل نقل - لیږد پیچلتیا: په nsp9 کې خوندي ځایونو ته د NiRAN-RdRp فرعي واحدونو مهم او انتخابي NMPylation

د پیټر سارنو لخوا ایډیټ شوی، د سټینفورډ پوهنتون د طب ښوونځي، سټینفورډ پوهنتون، کالیفورنیا، د دسمبر په 25، 2020 کې تصویب شو (د اکتوبر په 25، 2020 بیاکتنه)

موږ د کورونویرس - ټرانسکرپشن کمپلیکسونو په نقل کې د فرعي واحدونو ترمینځ تعامل راپور ورکوو ، کوم چې د تکثیر او تکامل محافظت لپاره اړین دي.موږ شواهد وړاندې کړل چې د nsp12 سره تړلي NiRAN ډومین په ټرانس کې د نیوکلیوسایډ مونوفاسفیټ (NMP) لیږدیز فعالیت لري، او د nsp9 (د RNA پابند پروټین) د هدف په توګه پیژندل شوی.NiRAN د NMP moiety covalent ضمیمه د محافظت شوي nsp9 امینو ټرمینس سره په یو عکس العمل کې کټالیز کوي چې په Mn2+ آیونونو او نږدې ساتل شوي Asn پاتې شونو باندې تکیه کوي.دا وموندل شوه چې د NiRAN فعالیت او nsp9 NMPylation د کورونویرس نقل لپاره اړین دي.ډاټا موږ ته اجازه راکوي چې د عصبي ویروس انزایم مارکر دا فعالیت په فرضیې کې پخوانیو مشاهداتو سره وصل کړو چې د RNA ویروسونو په یوه ټولګي کې د RNA ترکیب پیل په فعاله او تکامل ډول مطابقت لري.

د RNA پورې تړلي RNA پولیمیریز (RdRps) د Nidovirales (Coronaviridae، Arterioviridae، او 12 نورې کورنۍ) د امینو ټرمینل (N-ټرمینل) ډومین سره تړاو لري په غیر ساختماني پروټین (nsp) کې چې د پولی پروټین څخه خوشې کیږي، چې NiRAN نومیږي. 1ab د ویروس اصلي پروټیز (Mpro) څخه جوړ شوی دی.پخوا، د شریان ویروس NiRAN-RdRp nsp د خپل GMPylation/UMPylation فعالیت راپور شوی و، او دا وړاندیز شوی و چې د (اوس مهال نامعلوم) ویروس او/یا د حجرو بایوپولیمیریزیشن شیانو ته د نیوکلیوسایډ مونوفاسفیټ (NMP) لیږد لپاره یو انتقالي تولید کړي.دلته موږ وښیو چې کوروناویرس (د انسان کورونویرس [HCoV]-229E او شدید حاد تنفسي سنډروم کورونویرس 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) د Mn2+ انحصاري NMPylation فعالیت لري چې د Mpro-mediated nsp9 رامینځته کیدو له لارې له nsp9 څخه اخیستل کیږي. د N-ټرمینل فلانکینګ nsps په پروتولیک ډول خوشې کیږي، فاسفورامیډیټ د nsp9 په N-ټرمینل کې د لومړني امین (N3825) سره تړل کیږي.په دې عکس العمل کې یوریډین ټریفاسفیټ غوره نیوکلیوټایډ دی ، مګر اډینوسین ټریفاسفیټ ، ګانوسین ټریفاسفیټ ، او سیټیډین ټریفاسفیټ هم مناسب شریک سبسټریټونه دي.د تغیر مطالعات د بیا جوړونکي کورونویرس nsp9 او nsp12 پروټینونو په کارولو سره او په جینیکي ډول انجینر شوي HCoV-229E تغیراتو د حجرو په کلتور کې د NiRAN - منځګړیتوب nsp9 NMPylation او د ویروس نقل لپاره اړین پاتې شونه مشخص کړل.ډاټا د NiRAN د فعال سایټ د پاتې شونو وړاندوینه تایید کړه او په nsp9 NMPylation او په ویټرو کې د ویروس نقل کولو کې د nsp9 N3826 پاتې شونو مهم رول مشخص کړ.دا پاتې شونه د خوندي شوي N-ټرمینل NNE ټرایپټایډ سلسلې برخه ده او د nsp9 یوازینۍ غیر متزلزل پاتې شوني او د کورونویرس کورنۍ کې د هغې هومولوګ ثابت شوي.دا څیړنه د نورو ځړول شوي ویروسونو د NMPylation فعالیت فعالیت مطالعې لپاره قوي بنسټ چمتو کوي او د انټي ویروس درملو پراختیا لپاره احتمالي اهداف وړاندیز کوي.

د Nidovirales مثبت-Stranded RNA ویروس مختلف فقري او غیر فقاري حیوانات اخته کوي (1, 2).په دې ترتیب کې اوس مهال 14 کورنۍ (3) شاملې دي، چې له دې جملې څخه د کورونویرس کورنۍ په تیرو 20 کلونو کې په پراخه کچه مطالعه شوې.په هغه وخت کې، درې زونوټیک کورونوایروسونه د څارویو له کوربه څخه راوتلي او په انسانانو کې د شدید تنفسي انتاناتو په لویه کچه د خپریدو لامل شوي.د دوامداره وبا په شمول چې د شدید حاد ساري ناروغیو له امله رامینځته کیږي.د تنفسي سنډروم کورونویرس 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Nidoviruses یو ګډ جینوم سازمان شریکوي، او د جھلی پورې تړلی نقل نقل کولو کمپلیکس (RTC) فرعي واحد په 5-?²-ترمینل دوه پر دریمه برخه کې کوډ شوی او د ویروس ذرې اصلي ساختماني فرعي واحد، او همدارنګه ځینې لوازمات. .پروټین، د جینوم په دریمه برخه کې په 3??² کې کوډ شوی (1).د پلانارین ویروسونو یوې کورنۍ (Monoviridae) (8) پرته، ټول ځړول شوي ویروسونه د RTC فرعي واحدونه په دوه لوی خلاص لوستلو چوکاټونو (ORF) ORF1a او ORF1b کې کوډ کوي چې د جینومیک RNA څخه ژباړل شوي.ORF1a پولی پروټین (pp) 1a کوډ کوي، او ORF1a او ORF1b په ګډه pp1ab کوډ کوي.د ORF1a لخوا کوډ شوي اصلي پروټیز (Mpro) عمومي ګډون سره، pp1a او pp1ab دواړه په پروټیولوژیکي ډول په مختلفو غیر ساختماني پروټینونو (nsps) کې پروسس کیږي، چې د 3CLpro په نوم هم پیژندل کیږي، ځکه چې دا د 3Cpro سره هومولوژي لري د picornavirus ( ۹).داسې انګیرل کیږي چې دا nsps په لوی متحرک RTC کې راټول شوي، د جینومیک RNA (تکلیف) ترکیب او د فرعي جینومیک RNA (ټرانسکرپشن) ترکیب هڅوي، او د ORF1b (10??) لاندې د ORF بیان همغږي کولو لپاره کارول کیږي. ?12).

اصلي RTC کې د RNA پورې تړلي RNA پولیمیریز (RdRp) (13)، سوپر فامیل 1 هیلیکیس (HEL1) (14, 15) او د RNA پروسس کولو څو انزایمونه شامل دي چې په عمده ډول په ORF1b کې کوډ شوي او د کورونویرس کورنۍ کې شامل دي nsp12-nsp16 او nsp9-nsp12 په Arterioviridae کورنۍ کې (د 10-12 حواله وګورئ).RdRp او HEL1 د الوتونکو د ځنځير ویروس دوه (پنځمه برخه) خوندي شوي ډومینونه استازیتوب کوي او د نورو RNA ویروسونو په مینځ کې هومولوژي لري.داسې انګیرل کیږي چې اصلي نقل د نورو فرعي واحدونو لخوا مرسته کیږي ، پشمول د pp1a د کاربوکسي ټرمینل (C-ټرمینل) سیمې څخه خوشې شوي ډیری کوچني nsps ، د Mpro لاندې جریان (کورونا ویروس nsp5 او شریان ویروس nsp4 ، په ترتیب سره).دوی د کورنۍ پورې محدود محافظت او مختلف فعالیتونه لري (په 10-12 حواله کې بیاکتنه شوې).

په نسبي توګه په دې وروستیو کې، یو ډومین د ځانګړي ترتیب موټیف ځانګړتیاو سره په امینو ټرمینس (N-ټرمینس) کې وموندل شو چې د RdRp سره نږدې په ټولو نیست شوي ویروسونو کې، مګر نور RNA ویروسونه (16).د دې موقعیت او د نیوکلیوټایډ ټرانسفراز (نیوکلیوسایډ مونوفاسفیټ [NMP] لیږدیز) فعالیت پراساس ، دا ډومین د NiRAN (Nestvirus RdRp-related nucleotide transferase) په نوم نومول شوی.د NiRAN-RdRp دوه ګونی ډومین ترکیب د Coronaviridae په کورنۍ کې nsp12 او د Arterioviridae په کورنۍ کې nsp9 جوړوي، او په نورو نیستو ویریدای کې، NiRAN-RdRp تمه کیږي چې د ویروس پولی پروټین څخه د خپلواک nsp په توګه خوشې شي.په کورونویرس کې، NiRAN ډومین د 1/450 پاتې شونو لري او د لینکر سیمې (16?19) له لارې د C-ټرمینل RdRp ډومین سره وصل دی.د Equine Arteritis Virus (EAV) (Arteriviridae) کې، بیا جوړونکي nsp9 د Mn2+ ion-انحصار (ځان) UMPylation او GMPylation فعالیتونه ښیي، کوم چې په نیسټو ویروس، AN، BN او CN کې د پاتې کیدو په دریو خوندي ترتیبونو پورې اړه لري.چیرته چې N د NiRAN لپاره ولاړ دی) (16).د دې محرکونو N-Terminal flanking یو لږ محافظه کار شکل preAN دی.د دې پاتې شونو څخه ځینې یې د لرې پورې اړوند پروټین کناسونو کې هم ساتل شوي ، چیرې چې دوی د نیوکلیوسایډ ټریفاسفیټ (NTP) پابند او کتلیتیک فعالیت کې دخیل ښودل شوي (20, 21).د دې مشاهدې سره سم، د Pseudomonas syringae څخه په pseudokinase SelO کې ډیری کلیدي فعال سایټ پاتې شوني د وروستي خپاره شوي SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 سوپر کمپلیکس سره راټول کیدی شي.د کورونویرس نیران پاتې شونو ساتل شوي د الکترون مایکرو جوړښت کې سپر شوي.Recombinant پروټین (17).داسې انګیرل کیږي چې مستند شوی (خود) U/GMPylation به یو انتقالي حالت رامینځته کړي ترڅو (اوس مهال نامعلوم) سبسټریټ (16) ته NMP لیږدولو لپاره ، او د NiRAN او پروټین کایناس (17, 19) تر مینځ جوړښتي ورته والی فرضیه ده. NiRAN نور پروټینونه بدلوي.

ډیری ځانګړتیاوې، پشمول د نیسټډ ویروسونو سره د هغې ځانګړې او ځانګړې سیسټمیک تړاو او له RdRp څخه جنیټیک جلا کول، NiRAN د نیسټ ویروسونو لپاره یو مناسب کلیدي تنظیمي انزایم جوړوي، کوم چې د دوی د راڅرګندیدو او هویت لپاره مهم دی.مخکې، درې ممکنه دندې چې NiRAN پکې شاملې وې د جینوم / فرعي جینومیک ژباړې یا نقل / لیږد تنظیم کولو لپاره بلل شوي.کله چې په وخت کې موجود کمو او نیمګړو معلوماتو ته پام وکړو، هر فعالیت خپلې ګټې او زیانونه لري (16).پدې څیړنه کې، موږ موخه دا ده چې د کورونویرس بایو کیمیکل او ریورس جینیټیک مطالعات چې د دوه نسلونو استازیتوب کوي سره یوځای کړو، او زموږ موندنې د کورونویرس کورنۍ د طبیعي بدلون په ارتقايي پس منظر کې واچوو، ترڅو پدې پراسرار ډګر کې بصیرت ترلاسه کړو.موږ په RTC کې د طبیعي اهدافو د پیژندلو له لارې د NiRAN په پوهیدو کې د لوی پرمختګ راپور ورکوو، کوم چې (د دریو موجودو فرضیو په منځ کې) د عصبي ویروس RNA ترکیب پیل کولو کې د دې ډومین رول کې مرسته کوي.دا څیړنه د ویروس کوربه انٹرفیس کې د NiRAN نورو رولونو لپاره امکانات هم خلاصوي.

د کورونا ویروس nsp12 پورې اړوند NiRAN ډومین کې د انزایمي ځانګړتیاوو د مشخص کولو لپاره، موږ په E. coli کې د انسان کورونویرس 229E (HCoV-229E) nsp12 یو بیا جوړونکی شکل تولید کړ، په C-ټرمینس کې د His6 ټاګ سره، او یوځای شوی. پروټین د [α32-P] سره د NTP سره یوځای د MnCl2 په شتون کې لکه څنګه چې په موادو او میتودونو کې تشریح شوي.د عکس العمل محصول تحلیل د nsp12 (106 kDa) سره د رادیو لیبل شوي پروټین ګډ مهاجرت په ګوته کوي ، دا په ګوته کوي چې کوروناویرس nsp12 د covalent پروټین - NMP اضافه کولو رامینځته کولو کټالیز کوي ، په غوره توګه د یوریډین مونوفاسفیټ (UMP) سره رامینځته شوی (انډیا 1) ب).کمیتي تحلیل وښودله چې د نورو نیوکلیوټایډونو په پرتله، د UMP شاملولو سیګنال شدت له 2 څخه تر 3 ځله زیات شوی (شکل 1C).دا ډاټا د کورونویرس (16) د NiRAN ډومین د وړاندوینې NMP لیږدیز فعالیت سره مطابقت لري ، مګر دا په ګوته کوي چې د کورونویرس او شریان ویروس د NiRAN ډومین نیوکلیوټایډ غوره توبونه توپیر لري.

د HCoV-229E nsp12 د ځان NMPylation فعالیت.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) د 30 دقیقو لپاره د 6 mM MnCl2 په شتون کې د ټاکل شوي [α-32P] NTP سره مینځل شوی (د توضیحاتو لپاره توکي او میتودونه وګورئ).د عکس العمل محصولات د SDS-PAGE لخوا جلا شوي او د Coomassie روښانه نیلي سره رنګ شوي.(B) د رادیو لیبل شوي پروټین د فاسفورس عکس العمل په واسطه لیدل کیږي.د nsp12-His6 او د پروټین مالیکولر ماس مارکرونو موقعیتونه (په کلوډالټن کې) په A او B کې ښودل شوي. (C) د راډیو اکټیو سیګنال شدت (معنی ± SEM) د دریو خپلواکو تجربو څخه ټاکل شوی.*P≤0.05.د سیګنال ځواک (سلنه) د UTP سره تړاو لري.

که څه هم د NiRAN پورې اړوند انزایم فعالیتونه د حجرو کلتور کې د EAV او SARS-CoV د تکثیر لپاره اړین ښودل شوي (16) ، د NiRAN ځانګړي فعالیت او احتمالي اهداف لاهم ندي ټاکل شوي.په دې وروستیو کې راپور شوي د NiRAN او د پروټینونو د یوې کورنۍ تر مینځ جوړښتي ورته والی چې د پروټین کایناس په څیر فولډونه لري (17, 22) موږ دې ته وهڅول چې دا فرضیه و ازموئ چې NiRAN د نورو پروټینونو NMPylation کټالیز کوي.موږ د احتمالي هوموولوژس هدفونو سیټ رامینځته کړی ، پشمول د غیر ساختماني پروټینونو په شمول چې د HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10) لخوا کوډ شوي ، هر یو د C-ټرمینل His6 ټاګ لري (SI ضمیمه ، جدول S1) ، او دا پروټینونه د nsp12 په شتون یا نشتوالي کې د [α32-P] uridine triphosphate ([α32-P]UTP) سره غوړ کړئ.د بوواین سیروم البومین او MBP-LacZα فیوژن پروټین په E. کولی کې تولید شوي د کنټرول په توګه کار کوي (شکل 2A، لین 1 څخه تر 7 پورې).د رادیو لیبل شوي پروټین د سوډیم ډوډیسیل سلفیټ - پولیکریلامایډ جیل الیکٹروفورسیس (SDS-PAGE) او آټوراډیوګرافي لخوا تحلیل شوي، او دا وموندل شوه چې په عکس العمل کې یو قوي راډیو اکټیو سیګنال شتون درلود چې nsp12 او nsp9 لري.د سیګنال موقعیت د nsp9 مالیکولر ماس سره مطابقت لري، د nsp9 د nsp12 منځګړیتوب UMPylation په ګوته کوي (شکل 2B، ټریک 7).د ازموینې نور پروټینونه UMPylated ندي موندل شوي، کوم چې موږ دې پایلې ته رسولو چې nsp9 د nsp12 یو ځانګړی سبسټریټ دی.په 1 شکل کې ښودل شوي د ځان-NMPylation ډیټا سره مطابقت لري، nsp12 توان لري چې ټول څلور NMPs nsp9 ته انتقال کړي، که څه هم موثریت توپیر لري، UMP> اډینوسین مونوفاسفیټ (AMP)> guanosine monophosphate (GMP)> cytidine monophosphate (CMP) انځور).3 A او B).په دې ارزونه کې کارول شوي شرایطو لاندې (د عکس العمل او افشا کولو وخت لنډ کړئ، د nsp12 غلظت کم کړئ؛ مواد او میتودونه)، د nsp12 خود NMPylation کشف نشي کیدی (شکل 2B، لین 7، او شکل 1B پرتله کړئ)، کوم چې یو اغیزمن ثابت شوی (او څو پړاوونه) UMP له nsp12 څخه nsp9 ته لیږدول شوی.د UMP لیږدیز فعالیت د Mn2+ آیونونو شتون ته اړتیا لري، لکه څنګه چې په 3C شکل کې ښودل شوي، پداسې حال کې چې یوازې د UMP لیږدونې لږترلږه فعالیت د Mg2+ په شتون کې لیدل شوی، او د نورو دوه ویشل شوي کیشنونو په شتون کې هیڅ فعالیت ندی ازمول شوی.ورته معلومات د NMPylation په ارزونو کې ترلاسه شوي چې د سایټایډین ټریفاسفیټ (CTP)، ګانوسین ټریفاسفیټ (GTP)، او اډینوسین ټریفاسفیټ (ATP) (SI ضمیمه، شکل S1) لري.

HCoV-229E nsp12 منځګړیتوب د nsp9 UMPylation.د پروټین سبسټریټونو لړۍ (په شمول د بووین سیرم البومین، MBP-lacZα، او د HCoV-229E nsps لړۍ چې د C-ټرمینل His6 سره لیبل شوي چې د ORF1a لخوا کوډ شوي) د HCoV-229E nsp12-Histed⁺ د UMPylation فعالیت ارزولو لپاره کارول شوي. پروټینپروټین د [α-32P] UTP سره د 10 دقیقو لپاره د nsp12 په نشتوالي کې (A) یا (B) شتون کې لکه څنګه چې په موادو او میتودونو کې تشریح شوي.د A او B په پورتنۍ برخه کې، SDS-polyacrylamide جیل د Coomassie Brilliant Blue سره داغ شوی ښودل شوی، او د A او B په ښکته کې، اړونده آټوراډیوگرامونه ښودل شوي.د پروټین مالیکولر ډله ایز مارکر موقعیت (په کیلوډالټن کې) په کیڼ اړخ کې ورکړل شوی.د nsp12-His6 (B, top) موقعیت او د راډیو اکټیو سیګنال چې د nsp9-His6 (B, لین 7) سره د nsp12-His6 د انکیوبیشن په جریان کې مشاهده شوي هم په ګوته شوي ، کوم چې دا په ګوته کوي چې [α-32P] UMP ته nsp9-His6 (12.9 kDa)، کوم چې د نورو پروټینونو ازموینې لپاره ندي لیدل شوي.

HCoV-229E NiRAN منځګړیتوب د nsp9 NMPylation بایو کیمیکل او ویروولوژیکي ځانګړتیا.(A او B) د نیوکلیوټایډ شریک سبسټریټ رول په عکس العمل کې کارول کیږي.Nsp12-His6 او nsp9-His6 په معیاري NMPylation ارزونه کې د مختلف [α-32P] NTPs په شتون کې مخلوط شوي او انکیوب شوي دي.(A, top) Coomassie-stained nsp9-His6 د SDS-PAGE لخوا جلا شوی.(الف، لاندې) د جیل د ورته ساحې آٹوراډیوګراف.(ب) د ټاکل شوي نیوکلیوټایډ کوفیکٹر په شتون کې نسبي فعالیت (معنی ± SEM) د دریو خپلواکو تجربو څخه ټاکل کیږي.*P≤0.05.(ج) د فلزي آئنونو رول.ښودل شوی د معیاري NMPylation ازموینه د [α-32P] UTP او مختلف فلزي آئنونو په شتون کې ، هر یو د 1 mM غلظت سره.په C کې، پورته، Coomassie stained nsp9-His6 ښودل شوي، او په C کې، لاندې، اړونده آټوراډیوګرافي ښودل شوي.د لیبل شوي پروټین اندازه (په کیلوډالټن کې) د A او C کیڼ اړخ ته ښودل شوې. (D) د HCoV-229E nsp12-His6 متغیر شکل چې ټاکل شوي امینو اسید بدیل لیږدوي په [α-32P] UTP کې دی، لکه څنګه چې تشریح شوي. په موادو او میتودونو کې.د NMPylation عکس العمل کې تولید شوي رادیو لیبل شوي nsp9-His6 د فاسفوریلیشن امیجنګ (D, top) لخوا کشف شوي.د وحشي ډول (wt) پروټین سره پرتله شوي نسبي فعالیت په D کې ښودل شوی، او ښکته برخه د دریو خپلواکو تجربو څخه د اوسط (±SEM) په توګه اخیستل کیږي.ستوري د غیر خوندي پاتې پاتې شونو بدیلونه په ګوته کوي.(E) د p1 حجرو کلتور سپرناټینټ کې د ویروس ټایټر د انتان څخه 24 ساعته وروسته ترلاسه شوی د پلاک ارزونې لخوا ټاکل شوی.د انجینر شوي HCoV-229E میوټینټ NiRAN ډومین کې د کوډون بدیلونه په ګوته شوي (د پاتې شونو شمیره په pp1ab کې د دوی موقعیت پراساس ده).د نقل کمښت RdRp فعال سایټ میوټینټ nsp12_DD4823/4AA د کنټرول په توګه کارول شوی و.

د دې لپاره چې د NiRAN فعال سایټ ژوره پوهه ترلاسه کړي او د nsp9-ځانګړي NMP لیږدیز فعالیت پورې اړوند پاتې شونو مشخص کړي، موږ د تغیر تحلیل ترسره کړ، په کوم کې چې موږ محافظه کار پاتې شونو په NiRAN AN، BN او CN شکلونو کې ځای په ځای کړل ( 16) دا اله ده (SI ضمیمه، شکل S2).برسېره پردې، د محافظه کار ارګ څخه لیز یا د ارګ څخه د ارګ بدیلونو اغیزې په دوو قضیو کې ارزول شوي.د (منفي) کنټرول په توګه، هغه پاتې شونه چې د کورونویرس او نورو ځړول شوي ویروسونو په NiRAN ډومین کې نه یا لږ ساتل شوي دي د Ala سره ځای په ځای کیږي. BN) او D4280A (CN) د پام وړ کموي یا حتی د nsp12 له لارې nsp9 NMPylation له منځه وړي، پداسې حال کې چې پروټینونه د محافظه کار بدیلونو سره (R4178K)، K4116R) د دوی د فعالیت 60٪ او 80٪ ساتي، چې دا په ګوته کوي چې د دوی په اړه د محدودیتونو نرمښت. زنځیرونه د فزیکو کیمیکل له پلوه حساس دي (شکل 3D).د E4145A، D4273A، F4281A او D4283A د څو نورو خوندي پاتې شونو ځای په ځای کول خورا لږ زیانمن دي، او nsp9 UMPylation یوازې په اعتدال کې کم شوی.ورته پایلې د nsp9 NMPylation تعاملاتو کې ترلاسه شوي چې نور NTPs پکې شامل دي (شکل 3D او SI ضمیمه، شکل S3)، دا تاییدوي چې د ځانګړو امینو اسیدونو بدیلونو باندې لیدل شوي اغیزې د کارول شوي نیوکلیوټایډ شریک سبسټریټ ډول څخه خپلواک دي.بیا ، موږ د حجرو کلتور کې د کورونویرسونو په عکس العمل کې د دې nsp12 بدیلونو احتمالي اغیزې ازموینه وکړه.د دې لپاره، موږ د 5 -7 حجرو د لیږد لپاره د بیا جوړونې واکسین ویروس (23, 24) کې کلون شوي مناسب جینیکي ډول انجینر شوي بشپړونکي DNA (cDNA) ټیمپلیټونه وکارول.په دې حجرو کې تولید شوي د انتاني ویروس نسل ټیکټریشن وښودله چې ډیری HCoV-229E NiRAN تغیرات د امکان وړ ندي (شکل 3E).د غیر فعال ویروس میوټینټونو په ډله کې هغه بدیلونه شامل دي چې په ویټرو (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A) کې د NMP لیږدیز فعالیت له مینځه وړو یا د پام وړ کمولو لپاره ښودل شوي ، مګر دوه نور بدیلونه شتون لري (K4116R, E414A) % ساتل شوی؟د دوی د ویټرو NMPylation فعالیت وړاندیز کوي چې اضافي محدودیتونه پکې شامل دي.په ورته ډول، دوه نور بدلونونه (R4178K, F4281A) چې د NiRAN په ویټرو NMPylation فعالیت کې د معتدل کمښت لامل شوي ژوندي ویروسونه تولید کړي، په هرصورت، دا ویروس د نقل کولو له لارې د پام وړ ټیټرونه کم کړي.په 3D شکل کې ښودل شوي د ویټرو فعالیت ډیټا سره مطابقت ، د څلورو نورو پاتې شونو ځای په ځای کول چې په کورونویرس او/یا نورو ځړول شوي ویروسونو کې ندي ساتل شوي (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) د تولید وړ ویروسونه تولید کړي ، سره له دې د وحشي ډوله ویروس (شکل 3E) په پرتله یو معتدل کم شوی ټایټر.

د دې لپاره چې د دې مطالعې لپاره چې آیا د NiRAN منځګړیتوب شوي NMP لیږدیز فعالیت په فعال RdRp ډومین پورې اړه لري، دوه ساتل شوي Asp پاتې شونو په RdRp motif C کې د divalent فلزي آئنونو (11) په همغږي کې ښکیل دي د Ala لخوا ځای په ځای شوي. نتیجه پروټین nsp12_DD4823/4AA ساتل کیږي. د دې nsp9 NMPylation فعالیت، دا په ګوته کوي چې د nsp12 منځګړیتوب په vitro nsp9 NMPylation فعالیت د پولیمیریز فعالیت ته اړتیا نلري (SI ضمیمه، شکل S4).

د nsp12 لپاره د nsp9-ځانګړي NMP لیږدیز فعالیت رامینځته کولو وروسته ، موږ هڅه وکړه چې د ډله ایز سپیکرومیټري (MS) لخوا د NMP-nsp9 اضافه مشخص کړو.د بیا جوړونکي HCoV-229E nsp9 بشپړ پروټین ډله ایز سپیکٹرم په 12,045 Da (شکل 4A) کې لوړوالی ښودلی.د nsp12 اضافه کول د nsp9 کیفیت نه دی بدل کړی، دا په ګوته کوي چې nsp12 او nsp9 به د کارول شوي شرایطو الندې یو باثباته کمپلیکس جوړ نه کړي (منحل کول) (شکل 4A).د UTP او GTP په شتون کې، د عکس العمل ډله ایز اندازه چې په ترتیب سره nsp9 او nsp12 لري وښودله چې د UTP پروټین ډله 306 Da حرکت کوي، او د GTP پروټین ډله 345 Da حرکت کوي، دا په ګوته کوي چې هر nsp9 مالیکول یو UMP یا GMP سره تړلی دی. (انځور 4) C او D).داسې اټکل کیږي چې د NiRAN منځګړیتوب nsp9 NMPylation لپاره اړین انرژي د NTP هایدرولیسس او پیروفاسفیټ خوشې کیدو څخه راځي.که څه هم په دې عکس العمل کې د nsp12 (انزایم) په پرتله د nsp9 (هدف) 10 چنده اضافه کارول شوي، د nsp9 نږدې بشپړ NMPylation لیدل شوي، دا په ګوته کوي چې د nsp12 او nsp9 ترمنځ تعامل لنډمهاله دی، او nsp12 کولی شي نور nsp9 NMPylate کړي. په ویټرو مالیکول کې.

د nsp9 واحد NMPylation د nsp12 او UTP یا GTP په شتون کې.ښودل شوی د HCoV-229E nsp9 (SI ضمیمه، جدول S1) (AD) د غیر منحل شوي بشپړ پروټین ډله ایز سپیکٹرم دی.(A) nsp9 یوازې، (B) nsp9 + nsp12-His6، (C) nsp9 + nsp12-His6 د UTP په شتون کې، (D) nsp9 + nsp12-His6 د GTP په شتون کې.

د nsp9 پاتې شونو معلومولو لپاره چې د nsp12 لخوا UMPylated شوي، nsp9-UMP د ټریپسین سره پاک شوی.پایله شوي پیپټایډونه د نانو - لوړ فعالیت مایع کروماتګرافي (HPLC) لخوا جلا شوي او د ټنډیم ماس سپیکرومیټري (MS/MS) آنلاین لخوا تحلیل شوي.د بایونک سافټویر کڅوړې (پروټین میټریک) په کارولو سره د معلوماتو تحلیل د N-ټرمینل امینو اسید UMPylation ښودلی.دا په لاسي ډول تایید شوی.د مخکیني پیپټایډ [UMP]NNEIMPGK (SI ضمیمه، شکل S5A) د ټنډیم ډله ایز سپیکٹرم په 421 m/z کې یوه ټوټه څرګنده کړه، دا په ګوته کوي چې UMP د nsp9 د پاتې 1 سره تړاو لري.

د nsp9 په N-اصطلاح کې، Asn د Orthocoronavirinae (SI ضمیمه، شکل S6) د غړو ترمنځ ساتل کیږي.که څه هم موږ باور لرو چې د N-ټرمینل لومړني امین نایټروجن د UMP لپاره خورا احتمالي منل کونکی دی، موږ پریکړه وکړه چې په N-ټرمینل کې د NMP پابندۍ اضافي شواهد ترلاسه کړو.د دې دلیل لپاره، د HPLC لخوا پاک شوي غیر NMPylated او NMPylated N-ټرمینل پیپټایډ nsp9 د اکټون او سوډیم سیانوبوروهایډرایډ په شتون کې اخیستل شوي.د دې شرایطو لاندې، یوازې وړیا لومړني امینونه د پروپیل (25) سره تعدیل کیدی شي.د N-terminal nsp9 څخه ترلاسه شوي پیپټایډ د NNEIMPGK ترتیب سره دوه لومړني امینونه لري، یو یې د Asn په N-ټرمینس کې او بل یې د C-ټرمینس کې د Lys په اړخ کې.له همدې امله، پروپیل ګروپونه په دواړو سرونو کې معرفي کیدی شي.د غیر NMPylated پیپټایډونو استخراج شوي آئن کروماتگرامونه د SI ضمیمه کې ښودل شوي، شکل S5B.لکه څنګه چې تمه کیده، N-ټرمینل او C-ټرمینل (مونو) پروپیلیټ (SI ضمیمه، شکل S5B، پورتنۍ لین) او ډیپروپیلیټ پیپټایډز (SI ضمیمه، شکل S5B، ښکته لین) پیژندل کیدی شي.دا بڼه د nsp9 د NMPylated N-ټرمینل پیپټایډ کارولو سره بدلیږي.په دې حالت کې، یوازې د C-ټرمینل پروپیلیټ پیپټایډونه پیژندل کیدی شي، مګر د N-terminal propylated peptides او dipropylated peptides نه پیژندل شوي (SI ضمیمه، شکل S5C)، دا په ګوته کوي چې UMP د N-ټرمینل لومړني امین ته لیږدول شوي ترڅو د دې مخه ونیسي. د بدلونونو څخه ډله.

بیا، موږ (د الا یا سیر سره) ځای په ځای کوو یا د nsp9 په N-ټرمینس کې ساتل شوي پاتې شنې حذف کوو ترڅو د هدف مشخص محدودیتونه تعریف کړي.زموږ د MS ډیټا پراساس چې ښیې چې NiRAN د nsp9 د N-ټرمینل پاتې شونو لومړني امین سره د nsp9-NMP اضافه کوي، موږ داسې انګیرنه وکړه چې nsp9 NMPylation د ویروس ماسټر پروټیز (Mpro, nsp5) ته اړتیا لري ترڅو د nsp9 N-ټرمینل خوشې کړي. د پولی پروټین مخکینۍ.د دې فرضیې د ازمایښت لپاره، موږ یو پخوانی پروټین nsp7-11 تولید کړ چې په E. coli کې nsp9 لري او د [α-32P] UTP (مواد او میتودونو) په شتون کې د معیاري NMPylation ازموینه ترسره کړه.لکه څنګه چې په شکل 5A (لین 3) کې ښودل شوي، د nsp7-11 مخکینۍ نه قطع شوی د nsp12 سره راډیو لیبل نلري.په مقابل کې، که nsp7-11 د nsp9 (او نور nsps) له مخکینۍ څخه د خوشې کولو لپاره د بیا جوړونکي nsp5 لخوا پاک شي، د راډیو لیبل شوي پروټین چې د nsp9 سره مهاجرت کوي کشف کیږي، زموږ پایله تاییدوي چې NiRAN او N- د covalent nsp9-NMP اعلاناتو انتخابي جوړښت. .د N-ټرمینل Asn ترمینل لومړني امین (په pp1a/pp1ab کې 3825 موقعیت).دا پایله د nsp9 ساختمان په کارولو سره د تجربو لخوا هم ملاتړ کیږي، کوم چې په N-ټرمینس کې یو یا دوه اضافي پاتې شونه لري.په دواړو حالتونو کې، د nsp9 د NiRAN منځګړیتوب UMPylation لغوه شو (SI ضمیمه، شکل S7).بیا، موږ د nsp9 په N-ټرمینل کې د 3825-NNEIMPK-3832 پیپټایډ ترتیب څخه حذف شوي یو یا دوه Asn پاتې شونو سره یو پروټین تولید کړ.په دواړو حالتونو کې، nsp9 UMPylation په بشپړ ډول بند شوی و (شکل 5B)، اضافي شواهد وړاندې کوي چې اصلي nsp9 N-terminus د NMP ریسیپټر په توګه کار کوي.

د nsp9 پروټولوټیک پروسس کول او په nsp12 منځګړیتوب UMPylation کې د N-ټرمینل پاتې شونو رول.(A) nsp9 UMPylation وړیا nsp9 N-ټرمینل ته اړتیا لري.Nsp7-11-His6 د NMPylation کشف بفر کې په 30 °C کې مخکې له مخکې انکیوب شوی دی چې UTP لري د ریکومبیننټ Mpro (nsp5-His6) شتون یا نشتوالي کې.د 3 ساعتونو وروسته، د NMPylation ارزونه د nsp12-His6 په اضافه کولو سره پیل کړئ لکه څنګه چې په موادو او میتودونو کې تشریح شوي.عکس العمل چې nsp5-His6 (لین 1) او nsp9-His6 (لین 2) لري د کنټرول په توګه کارول کیده.د 10 دقیقو وروسته، غبرګون پای ته ورسید او د غبرګون مخلوط د SDS-PAGE لخوا جلا شو.پروټین د Coomassie Brilliant Blue (A, top) سره رنګ شوی و.د Nsp7-11-His6 مخکینۍ او پروسس شوی محصول چې د nsp5-His6 منځګړیتوب له امله رامینځته شوی په ښي خوا کې ښودل شوي.مهرباني وکړئ په یاد ولرئ (د دوی د کوچني اندازې له امله) چې په دې جیل کې nsp7 او nsp11-His6 د کشف وړ ندي، او عکس العمل د nsp5-His6 سره ضمیمه شوی (لین 1 او 4؛ د nsp5-His6 موقعیت د یوې قوي حلقې لخوا ښودل شوی) یا nsp9-His6 (لین 2) لږ مقدار MBP لري (د خلاص حلقو لخوا ښودل شوي) د پاتې شونو په توګه ځکه چې دوی د MBP فیوژن پروټینونو (SI ضمیمه، جدول S1) په توګه څرګند شوي.(B) د Nsp9-His6 ډول کې یو یا دوه N-ټرمینل Asn پاتې شونو شتون نلري (په pp1a/pp1ab کې د موقعیت له مخې د پاتې شونو شمیره) او د nsp12-His6 او [α-32P] UTP سره پاک او پاک شوي.B، SDS-PAGE د Coomassie سره داغ په پورتنۍ برخه کې ښودل شوی، B، اړونده آټوراډیوګراف په ښکته کې ښودل شوی.د مالیکولر وزن مارکر موقعیت (په کیلوډالټن کې) په ښي خوا کې ښودل شوی.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-ټرمینل ساتل شوي پاتې شونه د Ala یا Ser سره بدل شوي، او د پروټین ورته مقدار د nsp12-His6 منځګړیتوب UMPylation غبرګون کې کارول شوي.د عکس العمل محصولات د SDS-PAGE لخوا جلا شوي او د Coomassie Brilliant Blue (C, top) سره داغ شوي، او د رادیو لیبل شوي nsp9-His6 د فاسفورسینس امیجنگ (C، منځنۍ) لخوا کشف شوي.د وحشی ډوله (wt) پروټین په کارولو سره د حوالې په توګه (100٪ ته ټاکل شوی)، د نسبي NMPylation فعالیت (معنی ± SEM) د دریو خپلواکو تجربو څخه محاسبه شوی.(D) د HCoV-229E وحشي ډوله Huh-7 حجرو سره اخته شوي Huh-7 حجرو p1 حجرو کلتور سپرناټینټ کې د ویروس ټایټرونه ، او په nsp9 کې ټاکل شوي امینو اسید بدیل لیږدونکي میوټینټ د پلاک ارزونې لخوا ټاکل شوي.د نقل کمښت RdRp شکل C ډبل میوټینټ DD4823/4AA د منفي کنټرول په توګه کارول شوی و.

د nsp9 N-اصطلاح (په ځانګړې توګه د 1، 2، 3، او 6 موقعیتونه) د Orthocoronavirinae subfamily (SI ضمیمه، شکل S6) د غړو ترمنځ خورا خوندي دی.د nsp12- منځګړیتوب nsp9 NMPylation کې د دې پاتې شونو احتمالي رول مطالعې لپاره، د nsp9 په N-ټرمینس کې دوه پرله پسې Asn پاتې شونه د Ala یا Ser (یوازې یا په ترکیب کې) سره بدل شوي.د وحشي ډول nsp9 سره پرتله کول، د Ala یا Ser سره د N3825 ځای په ځای کول د nsp12 منځګړیتوب UMPylation (شکل 5C) کې دوه چنده کمښت المل شو.زموږ د دې پایلې سره سم چې NMPylation د N-ټرمینل د پاتې شونو د غاړې سلسلې پرځای په N-ټرمینل لومړني امین کې واقع کیږي، موږ د N3825A او N3825S ځای په ځای کولو سره د پام وړ پاتې کیدو NMPylation ولیدل.په زړه پورې خبره دا ده چې که دوهم Asn د Ala یا Ser سره بدله شي، nsp9 UMPylation ډیر قوي کم شوی (له 10 څخه ډیر ځله)، پداسې حال کې چې په 3، 4، او 6 کې د Ala ځای په ځای کول یوازې په nsp9 UMPylation باندې منځنۍ اغیزه لري (شکل 2) ) .5C).ورته پایلې د ATP، CTP یا GTP (SI ضمیمه، شکل S8) په کارولو سره ترلاسه شوي.په ټولیز ډول، دا معلومات په nsp9 NMPylation کې د N2826 کلیدي رول (په nsp9 کې 2 موقعیت) په ګوته کوي.

د nsp9 او NMPylation د N-terminus تر منځ د فعال ارتباط اضافي شواهدو ترلاسه کولو لپاره، موږ د کورونویرس کورنۍ د nsp9 سلسلې ډیری ترتیب ترتیب (MSA) ترسره کړ (د 104 او 113 پاتې شونو ترمنځ توپیر لري) (SI ضمیمه، شکل S6).په مجموع کې، د Orthocoronavirinae فرعي کورنۍ د 5 نسلونو په 47 (پېژندل شوي او پټونکي) ډولونو کې چې مختلف تی لرونکي حیوانات، مرغان او د حشراتو کوربه اخته کوي، په مجموع کې یوازې 8 پاتې شونې غیر متغیر موندل شوي.تر ټولو پراخ بدلونونه، په شمول د ړنګولو او داخلولو په شمول، د nsp9 د ثانوي جوړښت عناصرو ترمنځ دوره کې لیدل شوي، لکه څنګه چې د پخوانیو ساختماني مطالعاتو لخوا ټاکل شوي (26 ??28).د nsp9 د C-ټرمینل برخې په β strand او α helix کې پنځه متضاد پاتې شوني وموندل شول.درې متضاد پاتې شنې د nsp9 د N اصطلاح NNE شکل جوړوي.دا په ډاګه شوه چې د دې شکل دوهم Asn یوازینی غیر متزلزل پاتې شونی دی، کوم چې د لیرې پورې اړوند د چونګښې کورونویرس فرضی nsp9 لخوا هم شریک شوی، او د الفایلیټو ویروس په فرعي کورنۍ Letovirinae کې د مایکروهیلا لیټو ویروس 1 ډول استازیتوب کوي.د nsp9 ثانوي جوړښت عناصرو کې د پاتې شونو ساتنه د جوړښتي ملحوظاتو له مخې د فولډ یا پیژندل شوي RNA پابند ملکیتونو ساتلو لپاره معقول کیدی شي.په هرصورت، دا استدلال داسې نه بریښي چې د NNE په ساتنه کې پلي شي، او د دې مطالعې څخه مخکې، د خنډونو طبیعت چې د ټرایپټایډ ترتیب توپیر محدودوي په بشپړه توګه پټ شوی و.

د دې لپاره چې د nsp9-NMPylation او NNE محافظت د کورونویرس په نقل کې اهمیت وټاکو، موږ د HCoV-229E متغیرات تولید کړل، کوم چې د nsp9 N-ټرمینل پاتې شونو واحد یا دوه ځله بدیلونه لري، دا په ګوته کوي چې nsp9 NMPylation په ویټرو کې زیانمن دی.مخکې له دې چې موږ پیل وکړو، موږ هڅه کوو چې دې پوښتنې ته ځواب ووایو چې ایا دا بدیلونه (د nsp8|9 کلیویج سایټ ته نږدې) د C-ټرمینل pp1a سیمې پروټولوټیک پروسس اغیزه کوي.د nsp7-11 پولی پروټین جوړښتونو یوه ټولګه چې د nsp9 په N-ټرمینس کې ورته بدیلونه لري په E. coli کې تولید شوي او د بیا ترکیب Mpro سره پرې شوي.د څلورو سایټونو پروټولوټیک فاصله (د nsp9 فلانکینګ سایټ په شمول) د کوم معرفي شوي بدیلونو (SI ضمیمه، شکل S9) لخوا د پام وړ اغیزه نلري، په دې پروټینونو کې د جوړښتي بدلونونو پرته چې د Mpro-mediated nsp8|9 cleavage سره مداخله کوي (یا نور) ویب پاڼه

د Huh-7 حجرې د جینوم اوږدوالی HCoV-229E RNA سره لیږدول شوي، په nsp9 N ټرمینس کې په خوندي شوي NNE tripeptides (N3825, N3826، او E3827) کې د Ala یا Ser بدیلونو کوډ کول، دا ښیې چې ډیری بدلونونه وژونکي دي.موږ وکولی شو د N-ټرمینل Asn (N2835A یا N2835S) د سیر یا الا په ځای په ځای کولو سره ویروس وژغورو ، مګر د NNE ترتیب (N3826A, N3826S, NN3825/6AA) کې د نورو واحد او دوه اړخیز بدلونونو سره د ویروس په رغولو کې پاتې راغلل. NN3825/6SS) , E3827A) (شکل 5D).

دا پایلې په ګوته کوي چې په نسجونو کلتور کې د کورونویرس نقل کول محدود دي ( ورته یا ورته) ، په بدن کې د nsp9 NMPylation سایټونو طبیعي تغیر محدودوي ، او د کورونویرس ژوند دوره کې د دې غبرګون کلیدي رول ملاتړ کوي.

د تجربو په وروستي سیټ کې، موږ د C-ټرمینل His6 لیبل SARS-CoV-2 nsp12 او nsp9 تولید کړل، او په E. coli کې د nsp12 دوه متغیر شکلونه.په NiRAN او RdRp ډومینونو کې د فعال سایټ پاتې شونو په ترتیب سره د Ala پرځای کارول شوي (شکل 6A او SI ضمیمه، جدول S2).په SARS-CoV-2 nsp12 کې K4465 د HCoV-229E (SI ضمیمه، شکل S2) کې د K4135 سره مطابقت لري، کوم چې د NiRAN فعالیت او HCoV-229E نقل (شکل 3D او E) لپاره اړین ثابت شوی.دا پاتې شونه د شریان ویروس EAV nsp9 K94 پاتې شونو سره هم مطابقت لري، کوم چې مخکې د NiRAN self-UMPylation/self-GMPylation (16) لپاره اړین ښودل شوی و.لکه څنګه چې په 6B شکل کې ښودل شوي، SARS-CoV-2 nsp12 د UMP لیږدیز فعالیت لري چې nsp9 د سبسټریټ په توګه کاروي، پداسې حال کې چې د nsp12_K4465A فعال سایټ میوټینټ غیر فعال دی.د RdRp motif C د SDD ځانګړتیا ترتیب کې دوه ځله بدیل د UMP لیږدیز فعالیت اغیزه نه کوي (شکل 6B)، دا په ګوته کوي چې د RdRp فعالیت په nsp9 UMPylation کې مستقیم اغیزه نلري.ورته معلومات د CTP، GTP او ATP (SI ضمیمه، شکل S10) په کارولو سره ترلاسه شوي.په لنډیز کې، دا معلومات په ګوته کوي چې د NiRAN منځګړیتوب nsp9 NMPylation په کورونویرس کې محافظه کار فعالیت لري چې د اورتوکورونا ویروس فرعي کورنۍ مختلف نسل نمایندګي کوي.

SARS-CoV-2 nsp12- منځګړیتوب د nsp9 NMPylation.(A) Coomassie stained SDS-polyacrylamide gel د NMPylation په ازموینه کې کارول شوي بیا جوړونکي پروټین ښیې.د کنټرول په توګه، د SARS-CoV-2 nsp12 په NiRAN ډومین (K4465A) او RdRp ډومین (DD5152/3AA) کې د فعال سایټ بدیل سره یو متغیر پروټین کارول شوی و.د پاتې شونو شمیره په pp1ab کې د موقعیت پراساس ده.(B) د nsp9-His6 او [α-32P]UTP په کارولو سره د UMPylation کشف آټوراډیوګراف د nsp12-His6 د سبسټریټ په توګه (وحشی ډول [wt] او mutant).د لیبل شوي پروټین مالیکولر ډله (کیلوډالټن کې) په ښي خوا کې ښودل شوي.

د NiRAN ډومینونه عموما په Nidovirales (16) کې ساتل کیږي، دا په ګوته کوي چې دوی د Nidovirus د تکثیر لپاره اړین انزیماتیک عکس العملونه هڅوي.په دې څیړنه کې، موږ وتوانیدلو ثابته کړو چې د کورونویرس NiRAN ډومین NMP (د NTP څخه تولید شوی) nsp9 ته لیږدوي، یو پراسرار RNA پابند پروټین چې د ویروس په نقل کې ښکیل دی (26 ?? 29)، ترڅو دا د طبیعي هدف په توګه وټاکي او د کورونویرس RTC شریک.

د NiRAN ډومین درې ترتیب شکلونه شریکوي (AN، BN، او CN)، کوم چې د پاتې شونو خورا لږ شمیر لري چې په ټولو کورنیو کې د مونوفیلیټیک خو خورا توپیر لرونکي Nidovirales ترتیب کې ساتل کیږي (8, 16).وروستیو څیړنو ښودلې چې دوی په ساختماني ډول د پروټین کناز په څیر د پروټینونو په پراخه کچه غیر مشخص شوي کورنۍ پورې اړه لري، کوم چې په اصل کې د SelO کورنۍ (17, 19, 22, 30, 31) په نوم یادیږي.د SelO اړوند پروټینونه د کیناز فولډونه لري، مګر په کلاسیک کنیزونو کې د فعال سایټ ډیری خوندي پاتې کیدو نشتوالی (22, 32).د فعال سایټ سره تړلي او د ځانګړو تعاملاتو لخوا ثبات شوي د ATP مالیکولونو د متقابل لوري پراساس ، SelO فرضیه شوې او وروسته یې د پروټین سبسټریټ (22) ته د AMP (د فاسفیټ پرځای) لیږدولو تایید کړی ، پداسې حال کې چې یو بل باکتریا د SelO په څیر پروټین YdiU لري. په دې وروستیو کې ښودل شوي چې د Tyr او د هغه د مختلف پروټین سبسټریټ (33) پاتې شونو ته د UMP covalent ضمیمه کټالیز کوي.

د کورونویرس NiRAN ډومین د فعال سایټ پاتې شونو وړاندوینې تایید او پراخولو لپاره، موږ د بایو کیمیکل او ریورس جینیکیک میتودونو څخه کار واخیست ترڅو په کورونویرس nsp12 (شکل 3D او E او SI ضمیمه، شکل S3 او جدول) S1â د بدلون تحلیل ترسره کړي. S4).ډاټا ښیي چې د HCoV-229E K4135, R4178 او D4280 Ala سره ځای په ځای کول د ویټرو NMP لیږدیز فعالیت او د حجرو کلتور کې د ویروس نقل کول له مینځه وړي (شکل 3D او E او SI ضمیمه، شکل S3)، په NTP γ-فاسفیټ کې د دوی شتون ملاتړ کوي. (K4135، R4178) او د فعال سایټ فلزي آیونونو همغږي (D4280).د E4145A د محافظت شوي ګلو بدیل د الوتونکو د ځنځير ویروس په لړ کې د K4135 (17) موقعیت د ثبات لپاره وړاندوینه شوې وه چې د ویروس نقل له مینځه وړو لپاره ښودل شوي، مګر په حیرانتیا سره، فعالیت په ان ویټرو NMPylation امتحان کې ساتل شوی و (شکل 3D او E او د SI ضمیمه، شکل S3 او جدولونه S1-S4).ورته مشاهده هغه وخت رامینځته شوه کله چې ورته بدیل د سالمونیلا ټایفیموریم (E130A) (33) په YdiU هومولوژ کې معرفي شو.یوځای اخیستل شوي، دا ډاټا د دې ساتل شوي پاتې شونو تنظیمي فعالیت ملاتړ کوي نه د کتلیتیک فعالیت.

د HCoV-229E NiRAN ډومین (8) کې د نیستو ویروس په حد کې د خوندي شوي Phe پاتې شونو (F4281A) ځای په ځای کول په ویټرو کې د NMPylation فعالیت کې کمښت او د حجرو کلتور کې د ویروس په نقل کې د پام وړ کمښت لامل شوی (شکل 3D, E او SI) ضمیمه، شکل S3).معلومات د دې پاتې شونو مهم تنظیمي فعالیت سره مطابقت لري، لکه د هومولوژس DFG شکل Phe پاتې شونو مخکې ښودل شوي.په کلاسیک پروټین کنیزونو کې، دا د Mg2+ باندنی لوپ برخه ده او د نخاع په راټولولو او تنظیم کولو کې مرسته کوي؟؟؟د اغیزمن کتلایټیک فعالیت لپاره اړین دی (32، 34).د K4116 پاتې شونو لپاره د Ala او ارګ ځای په ځای کول (په preAN شکل کې)، په ترتیب سره، د ویروس نقل له منځه وړل او لکه څنګه چې تمه کیده، په ویټرو کې د NMP لیږدیز فعالیت باندې مختلف اغیزې درلودې، د امینو اسید اړخ سلسلې پورې اړه لري چې معرفي شوي (شکل 3D او E او SI ضمیمه) ، شکل S3).فعال معلومات د ساختماني معلوماتو سره مطابقت لري، دا په ګوته کوي چې دا پاتې شونو د ATP فاسفیت سره تعامل رامینځته کړی (17).د نورو ځپلو ویروس کورنیو NiRAN ډومین کې، د HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 موقعیت د Lys، Arg یا His (8) لخوا نیول شوی، دا په ګوته کوي چې د دې ځانګړي پاتې شونو فعالیت محدودیت آرام شوی.د D4188A او D4283A بدیل د انزایم فعالیت له مینځه وړي یا په کلکه کموي او د ویروس تکثیر له مینځه وړي (شکل 3).دا دوه پاتې شونه په ډیری (مګر ټول نه) په ځړول شوي ویروسونو کې ساتل کیږي (8)، چې د کورنۍ ځانګړي خو ممکن غیر کټالیټیک فعالیت په ګوته کوي.د Ala بدیل د څو نورو Lys او Asp پاتې شونو (K4113A, D4180A, D4197A او D4273A) چې په کورونویریډی یا نورو نیستیو ویریدای کورنیو کې ساتل شوي ندي (8) د کنټرول په توګه کارول شوي.لکه څنګه چې تمه کیده، دا بدیلونه په پراخه کچه د زغم وړ دي، د انزایم فعالیت کې لږ کمښت او په ځینو مواردو کې د ویروس نقل سره (شکل 3 او SI ضمیمه، شکل S3).په ټولیز ډول، د کورونویرس میوټاجینسیس ډیټا د EAV NiRAN-RdRp (16) د ځان-GMP او ریورس جینیکیک ډیټا سره خورا مطابقت لري ، په کوم کې چې د EAV nsp9 (کورونا ویروس nsp12 اورتولوژ) پاتې شونه K94 (د HCoV- 229E K4135 سره مطابقت لري) ، مهم دندې. R124 (د R4178 سره مطابقت)، ​​D132 (د D4188 سره مطابقت)، ​​D165 (د D4280 سره مطابقت)، ​​F166 (د F4281 سره مطابقت لري).برسېره پردې، د HCoV-229E mutagenesis ډیټا د مخکینۍ راپور شوي SARS-CoV ریورس جنیټیک ډیټا (16) سره مطابقت لري او پراخ شوي، لکه څنګه چې د ورته CN موټیف Phe-to-Ala mutant SARS-CoV_nsp12 لپاره لیدل شوي ورته ورته دي. فینوټائپ بیان شوی -F219A او HCoV-229E_F4281A (شکل 3 D او E او SI ضمیمه، شکل S3 او جدول S1-S4).

د EAV اورتولوګز (16) سره پرتله کول، کوم چې د UTP او GTP لپاره روښانه لومړیتوب لري (په ځان کې NMPylation غبرګون کې)، زموږ څیړنه ښیي چې د کورونویرس NiRAN ډومین (د HCoV-229E او SARS-CoV-2 لخوا استازیتوب کیږي) په مؤثره توګه کیدی شي. ټول څلور NMPs لیږدول شوي، که څه هم د UMP لپاره لږ لومړیتوب شتون لري (شکل 1 او 3).د ځانګړي NTP شریک سبسټریټ نسبتا ټیټ ځانګړتیا د وروستي راپور شوي SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 سوپرکمپوزیټ جوړښت سره مطابقت لري ، په کوم کې چې ADP-Mg2+ د NiRAN فعال سایټ سره تړاو لري ، مګر د اډینین برخې سره ندي. د ځانګړو تعاملاتو رامینځته کول (17).زموږ په څیړنه کې، د نیوکلیوټایډ ډول چې د NMPylation عکس العمل کې کارول کیږي د متون پروټین (SI ضمیمه، شکل S3) په فعالیت باندې هیڅ توپیر نلري، دا په ګوته کوي چې د دې پاتې شونو څخه هیڅ یو د ځانګړي نیوکلیوبیس سره نږدې تړاو نلري.ساختماني اساس او احتمالي بیولوژیکي اهمیت د مختلف NTP شریک سبسټریټ غوره توبونه چې د کورونویرس او شریان ویروسونو NiRAN ډومینونو کې مشاهده شوي د مطالعې لپاره پاتې دي؛دوی ممکن ریښتیا وي یا ممکن د دوی اړوند مطالعاتو محدودیتونو له امله وي.په اوس وخت کې، دا نشي رد کیدی چې د شریان ویروس نیران ډومین احتمالي NMPylator فعالیت (د مخکینیو ځانګړتیاوو په پرتله د ځان NMPylation فعالیت په پرتله) یو مختلف شریک سبسټریټ غوره توب لري، په پام کې نیولو سره چې د شریان او کورونویرس ترمنځ ورته والی د NiRAN ډومین په خپل حد کې دی.د ترتیب پر بنسټ پرتله کول (16).د pseudokinase SelO په پرتله، چې Mg2+ د کوفیکٹر په توګه کاروي، د کورونویرس او شریان ویروس NiRAN فعالیت په Mn2+ (16) پورې اړه لري (شکل 3C او SI ضمیمه، شکل S1).د UTP لپاره د Mn2+ انحصار او څرګند ترجیح د پروټین NMPylators غیر معمولي ځانګړتیا ده، او یوازې په دې وروستیو کې د سالمونیلا ټایفیموریم په YdiU پروټین کې تایید شوی، کوم چې د Mn2+ انحصاري پروټین چپرون UMPylation کټالیز کوي ترڅو د فشار انډکشن سیل ATP حوض څخه د حجرو ساتنه وکړي. ۳۳).

د کورونویرس NiRAN ډومین او سیلولر پروټین کنازس (17, 19) تر مینځ پدې وروستیو کې بیان شوي جوړښتي ورته والی د NiRAN وړتیا لپاره اضافي ملاتړ چمتو کوي ترڅو د نورو پروټینونو سره NMP په ګډه توګه وصل کړي چې موږ پدې څیړنه کې راپور ورکړی.موږ د HCoV-229E ORF1a لخوا کوډ شوي پروټینونو باندې د ممکنه NiRAN اهدافو لپاره زموږ لټون متمرکز کړ، کوم چې په مستقیم یا غیر مستقیم ډول د RTC د ORF1b-انکوډ شوي نقل سره مرسته کوي (12, 35).زموږ تجربې د nsp9 اغیزمن او ځانګړي NMPylation لپاره بشپړ شواهد وړاندې کوي (شکل 2).که هدف پروتین په دوړو کې کارول کیږي چې د انزایم (nsp12) څخه 8 څخه تر 10 ځله لوړ وي، نو دا تایید کیږي چې nsp9 په بشپړ ډول (مونو) NMP شوی (شکل 4).موږ دې نتیجې ته ورسېدو چې د nsp12 او nsp9 ترمنځ تعامل لنډمهاله دی او د nsp9 (د نورو RTC فرعي واحدونو په نشتوالي کې) سره به یو باثباته کمپلیکس جوړ نه کړي.دا پایله د SARS-CoV پروټوم (35) کې د پروټین تعامل مطالعاتو لخوا ملاتړ کیږي.د MS تحلیل د nsp9 د N-ټرمینل پاتې شونو لومړني امین د NMPylation سایټ (SI ضمیمه، شکل S5) په توګه وپیژندل.د فاسفورامیډیټ بانډ جوړښت او د N-ټرمینل امینو ګروپ د NiRAN منځګړیتوب شوي NMPylation فعالیت د Pseudomonas syringae SelO-mediated AMPylation عکس العمل څخه توپیر کوي، کوم چې په Ser، Thr، یا Tyr کې د O-linked AMP جوړښت کټالیز کوي (د پیپټایډز اډیټایډز) 22)، او S. typhimurium YdiU د O-linked (د Tyr سره) او N-linked (د هغه سره) پیپټایډ-UMP اضافه کوي.د پروټینونو د SelO کورنۍ په اړه محدود معلومات په ګوته کوي چې د دې لوی پروټین کورنۍ غړي د پیپټایډ - NMP اضافه کولو په جوړښت کې خورا توپیر لري.دا یو په زړه پوری مشاهده ده چې د نورو مطالعې مستحق ده.

پدې څیړنه کې ترلاسه شوي معلومات موږ ته د دې لامل شوي چې فرض کړو چې د nsp9 NMPylation وړیا N-terminus ته اړتیا لري.د ویروس د نقل کولو په شرایطو کې، دا به د nsp8 | nsp9 پروسس کولو سایټ د پروټیولوټیک کلیویج لخوا چمتو شي چې د ریپلیکس پولی پروټین pp1a په منځګړیتوب کې د Mpro او pp1ab لخوا منځګړیتوب شوی.په ډیری کورونویرسونو کې ، د دې ځانګړي سایټ (VKLQ|NNEI په HCoV-229E کې) او د نورو ټولو کورونویرس Mpro کلیویج سایټونو ترمینځ توپیر Asn دی (د بل کوچني پاتې کیدو پرځای ، لکه اله ، سیر یا ګلی) P1â اشغالوي؟؟؟ځای (۳۶).په لومړنیو مطالعاتو کې ترلاسه شوي د پیپټایډ فایبر ډیټا وښودله چې د nsp8|nsp9 سایټ د فاصلې موثریت د نورو سایټونو په پرتله ټیټ و ، دا په ګوته کوي چې 1) دا ځانګړی سایټ ممکن د C-ټرمینل په وخت همغږي شوي پروسس کې تنظیمي رول ولري. pp1a سیمه، یا 2) د ویروس په نقل کې د ځانګړي محافظت شوي nsp9 N-ټرمینس رول (37).زموږ ډاټا (شکل 5A) وښودله چې د nsp9 بیا جوړونکي بڼه چې د اصلي N-ټرمینل ترتیب لیږدوي په اغیزمنه توګه د nsp12 لخوا NMPized شوی.د N-ټرمینل فلانکینګ ترتیب د فاکتور Xa (nsp9-His6؛ SI ضمیمه، جدول S1) یا د Mpro- منځګړیتوب کلیویج (nsp7-11-His6؛ شکل 5A او SI ضمیمه، جدول S1) لخوا لرې شوی.په مهمه توګه، د nsp9-مخنیوي nsp7-11-His6 غیر قطع شوي nsp12 د NMPylation سره مقاومت ښودلی، کوم چې زموږ د معلوماتو سره مطابقت لري، دا په ګوته کوي چې د nsp9-NMP اضافه کول د N-ټرمینل لومړني امین (SI ضمیمه، شکل S5) له لارې رامینځته کیږي. .د دې لپاره چې د NiRAN سبسټریټ ځانګړتیا ژوره پوهه ترلاسه کړو، موږ بیا د nsp9 نږدې N-ټرمینل پاتې شونو باندې تمرکز وکړ.د نورو پروټینونو په نشتوالي کې، دوی د جوړښت له پلوه انعطاف منونکي دي، د nsp9 (26 28، 38) په غیر لیبل شوي بڼه کې د دوی د کشف کیدو مخه نیسي، د دوی محدود طبیعي توپیر په ګوته کوي چې دا د مهم ترتیب ځانګړي (ثانوي جوړښت پورې اړوند نه) له امله دی. د nsp9 N-ټرمینل ټوټې فعالیت.په دې سیمه کې د خوندي پاتې پاتې شونو اله بدیلونه (انځور 5C او D او SI ضمیمه، شکل S8) څرګندوي چې N3826 په ویټرو کې د nsp9 NMPylation لپاره اړین دی، پداسې حال کې چې د N3825A او E3827A بدیلونه د NMPylation د کمښت لامل کیږي، پداسې حال کې چې P3820 فرعي 3826 نه کوي. .په ښکاره ډول د nsp9 NMPylation اغیزه کوي.که څه هم د N-ټرمینل Asn (N3825A, N3825S) بدیل یوازې په nsp9 NMPylation او د حجرو کلتور (شکل 5C او D) کې د ویروس نقل باندې متوسط ​​​​اثر لري ، د N-ټرمینل 3825-NN dipe څخه د Asn پاتې شونو ترتیب حذف کول. ثابت شوی چې دا د ویروسونو لپاره وژونکی دی، دا په ګوته کوي چې په N-ټرمینس کې د بل پاتې شونو څخه مخکې د Asn پاتې شونو ته اړتیا ده، په غوره توګه Asn، که څه هم داسې ښکاري چې د ورته پاتې شونو بدیل په جزوي توګه زغملی شي (شکل 5B، C، او D).موږ دې نتیجې ته ورسیدو چې د 3825-NN ډیپپټایډ، په ځانګړې توګه د کورونویرس رینج (SI ضمیمه، شکل S6) کې ساتل شوي او اړین N3826 پاتې شوي، د NiRAN په فعال سایټ کې د nsp9 N-ټرمینس سمه پابندۍ او سمت یقیني کوي.

د ټولو فرعي فامیلونو د خوندي شوي ګلو لپاره د Ala (E3827A) ځای په ځای کول په ویټرو کې nsp9 NMPylation ساتي مګر د حجرو کلتور کې د ویروسونو لپاره وژونکي دي (شکل 5C او D) ، د دې پاتې کیدو اضافي فعالیت په ګوته کوي ، د مثال په توګه په کلیدي تعاملاتو کې (NMPylated یا نه بدلیدونکي) ) nsp9 N-terminus او نور عوامل چې د ویروس په نقل کې دخیل دي.د Nsp9 بدلونونو د nsp9 پروټولوټیک پروسې اغیزه نده کړې یا کوم نږدې nsps (39) (SI ضمیمه، شکل S9)، دا په ګوته کوي چې د څو nsp9 بدلونونو وژونکي فینوټایپونه لیدل شوي د C proteolytic پروسې - ټرمینل pp1a ساحې د بې نظمۍ له امله ندي رامینځته شوي. .

پورتني معلومات شواهد وړاندې کوي چې په pp1a/pp1ab کې د nsp8|9 cleavage سایټ د Mpro منځګړیتوب درملنې وروسته، د nsp9 N-terminus UMPylated (یا په جزوي توګه د بل NMP سره تعدیل) کیدی شي.برسېره پردې، د nsp9 د N-terminus غوره ساتنه (په شمول د کورونویرس کورنۍ کې د واحد او غیر متغیر Asn پاتې شونو په شمول) او پدې څیړنه کې ترلاسه شوي برعکس جینیاتي ډیټا (انځور 3E او 5D) موږ دې پایلې ته رسولو چې تشریح شوي nsp9 NMPylation. د بیولوژیکي پلوه تړاو لري او د کورونویرس نقل لپاره اړین دی.د دې تعدیل فعالې پایلې د مطالعې لپاره پاتې دي، د بیلګې په توګه، مخکې تشریح شوي (غیر مشخص) nsp9 (غیر ترمیم شوی بڼه) د RNA پابند فعالیت (2628).د N-terminal NMPylation کیدای شي د پروټین یا RNA سبسټریټونو سره د nsp9 تعامل یا د مختلف څلور سطحو مجلسونو رامینځته کیدو اغیزه وکړي.دا په ساختماني مطالعاتو کې لیدل شوي او تایید شوي چې په فعاله توګه د کورونویرس نقل سره تړاو لري، که څه هم په ځانګړې توګه د دې بدلون په صورت کې د نشتوالي په صورت کې (26- ââ29، 40).

که څه هم د کورونویرس نیران ډومین هدف مشخصیت لاهم اړتیا لري په ډیر تفصیل سره مشخص شي ، زموږ معلومات ښیې چې د کورونویرس NiRAN ډومین د پروټین هدف مشخصیت خورا تنګ دی.که څه هم د ټولو nidovirus کورنیو په NiRAN ډومین کې د کلیدي فعال سایټ پاتې شونو (8, 16) ساتنه په کلکه د دې پروټینونو ساتل شوي NMPylator فعالیت ملاتړ کوي، د دې ډومین د سبسټریټ پابند جیب پاتې شونو پیژندنه او ساتنه د ځانګړتیا وړ پاتې کیږي. ، او کیدای شي د Nidovirales موخو د مختلفو کورنیو ترمنځ توپیر ولري.په ورته ډول، د نورو ځړول شویو ویروسونو اړوند هدفونه لاهم ندي ټاکل شوي.دوی ممکن د nsp9 یا نورو پروټینونو لرې ارتولوګونه وي، ځکه چې د پنځو ریپلیکس ډومینونو څخه بهر ترتیبونه چې په عمومي ډول په نیست شوي ویروسونو کې ساتل کیږي لږ ساتل کیږي (8)، په شمول د Mpro او NiRAN ترمنځ د جینوم سرې په شمول، د دوی په منځ کې، nsp9 موقعیت لري. کرونا وایرس.

برسېره پردې، موږ اوس مهال دا احتمال رد نه کړو چې د NiRAN ډومین اضافي (د سیلولر په شمول) اهداف لري.په دې حالت کې، دا د یادولو وړ ده چې د دې راڅرګند شوي پروټین NMPylators (NMPylators) (30، 31) کې د باکتریا هومولوګونه "ماسټر تنظیم کونکي" ښکاري؟NMP د سیلولر پروټین مختلف ډولونه تعدیل کوي ترڅو د دوی لاندې فعالیتونو تنظیم یا له مینځه یوسي، په دې توګه په بیالبیلو بیولوژیکي پروسو کې رول لوبوي، لکه د سیلولر فشار غبرګون او ریډکس هوموستاسیس (22, 33).

په دې څیړنه کې (انځورونه 2 او 4 او د SI ضمیمه، S3 او S5 شکلونه)، موږ وتوانیدل چې دا ثابته کړو چې nsp12 د UMP (NMP) برخه په nsp9 کې یو واحد (محفوظ شوي) حالت ته لیږدولې، پداسې حال کې چې نور پروټینونه په nsp9 کې ندي بدل شوي. د شرایطو لاندې کارول کیږي، د ښه تعریف شوي (د لوز پرځای) د سبسټریټ ځانګړتیا ملاتړ کیږي.د دې سره په مطابقت کې، د N-ټرمینل nsp9 NMPylation سره په پرتله، د nsp12 خپل NMPylation فعالیت خورا ټیټ دی، د دې کشف کول د آټوراډیګرافي اوږد وخت ته اړتیا لري، او د nsp12 غلظت کې 10-ډال زیاتوالي کارول کیږي.برسېره پردې، زموږ د MS تحلیل د nsp12 د NMPylation لپاره شواهد چمتو کولو کې پاتې راغلل، کوم چې وړاندیز کوي چې د NiRAN ډومین ځان NMPylation (په غوره توګه) یو ثانوي فعالیت دی.په هرصورت، دا باید په پام کې ونیول شي چې نورو مطالعاتو لومړني شواهد وړاندې کړي چې د باکتریا NMPylator د ځان AMPylation حالت ممکن د نورو پروټین سبسټریټونو باندې د NMPylation فعالیت کنټرول کړي (22, 33).له همدې امله، د EAV nsp9 (16) او کورونویرس nsp12 (دا څیړنه) لپاره راپور شوي د ځان NMPylation فعالیتونو احتمالي فعال اغیزو تحقیق کولو لپاره لا ډیرو څیړنو ته اړتیا ده، په شمول د C-ټرمینل RdRp ډومین فولډ کولو باندې وړاندیز شوي چاپرون په څیر اغیز (. 16)).

مخکې، د nidoviral NiRAN ډومین د ممکنه لاندې دندو دندو په اړه ډیری فرضیې په پام کې نیول شوي، په شمول د RNA ligase، RNA-capped guanylate transferase (16) او د پروټین پریمینګ فعالیت (16)، مګر هیڅ یو یې د موجوده لاندې دندو سره مطابقت نلري.په لاندې پوستونو کې ترلاسه شوي معلومات د اضافي انګیرنې پرته په عین وخت کې دي.په دې څیړنه کې ترلاسه شوي معلومات خورا مطابقت لري (مګر دا نشي ثابتولی) چې د NiRAN ډومین د پروټین هڅول شوي RNA ترکیب په پیل کې دخیل دی.مخکې داسې انګیرل کیده چې په 5 کې د NiRAN ډومین فعالیت؟²-RNA کیپینګ یا د RNA ligation تعاملات د دې او نورو معلوماتو ملاتړ لخوا اغیزمن ندي.له همدې امله، د مثال په توګه، د NiRAN فعال سایټ د عمومي اډې په توګه ساتل شوي Asp کې شامل ګڼل کیږي (D252 په Pseudomonas syringae SelO کې؛ D4271 په HCoV-229E pp1ab کې؛ D208 په SARS-CoV-2 nsp12 کې) (SI ضمیمه، شکل 2 ).S2) (17, 22, 33)، پداسې حال کې چې د ATP پورې تړلي RNA ligase او RNA کیپینګ انزایم کې کتلیزیز د covalent enzyme-(lysyl-N) -NMP منځګړیتوب لخوا ترسره کیږي، کوم چې د غیر بدل شوي Lys پاتې شونو کې شامل دي ( ۴۱).برسېره پردې، د محافظت شوي پروټین اهدافو لپاره د کورونویرس NiRAN د پام وړ ترتیب پراساس ځانګړتیا او د NTP شریک سبسټریټونو لپاره آرامۍ ځانګړتیا (UTP غوره کوي) د NiRAN - منځګړیتوب کیپینګ انزایم یا RNA لیګیس په څیر دندو سره مخالفت کوي.

په ښکاره ډول، د تایید لپاره ډیری اضافي کار ته اړتیا ده، او که ثابت شي، د پروټین هڅول شوي RNA ترکیب کې د nsp9-UMP (nsp9-NMP) احتمالي رول په اړه توضیحات، کوم چې به څو په زړه پورې مګر (تر اوسه) مخکې راپور شوي راپورونه سره وصل کړي. .جلا جلا کتنې.د مثال په توګه، دا معلومه شوې چې د کورونویرس د منفي-سټرنډ RNA پای د oligo (U) سټنډ (42, 43) سره پیل کیږي.دا مشاهده د دې مفکورې سره مطابقت لري چې د منفي-سټرنډ RNA ترکیب د nsp9 د UMPylated شکل د پولی (A) tail ( محرکونو) سره په تړلو سره پیل کیږي ، کوم چې ممکن د دې RNA پابندۍ لخوا وده ومومي فعالیت او/یا تعامل. بل RTC پروټین.د UMP برخه چې د nsp9 لخوا چمتو کیږي بیا د nsp7/8/nsp12 منځګړیتوب oligouridylation لپاره د "پرائمر" په توګه کارول کیدی شي، په جینومیک RNA کې د 3??²-poly(A) دم یا بل oligo (A) لرونکی ترتیب په کارولو سره. د یوې نمونې په توګه کار کوي، د پیکورناویرس VPg پروټین (44) لپاره رامینځته شوي میکانیزم ته ورته دی.څه که چیرې وړاندیز "غیر معیاري" وي؟؟؟؟د (پروټین هڅول) د منفي سټنډ RNA ترکیب پیل د مشاهدو لپاره لینک چمتو کوي ، دا په ګوته کوي چې د کورونویرس منفي سټنډ RNA په پای کې UMP (د UTP پرځای) لري (42) ، کوم چې په ګوته کوي نیوکلیک اسید ډیسر د نامعلوم uridine-ځانګړي Endonuclease پواسطه پای فاسفوریلیټ ماتوي.که تایید شي، دا نیوکلیک اسید هایدرولیټیک فعالیت کولی شي د نوي منفي سټنډ له 5 ² پای څخه د nsp9 oligomeric UMPylated شکل خوشې کولو کې مرسته وکړي.د پروټین پریمینګ کې د nsp9 احتمالي رول د پخوانیو برعکس جینیکیک مطالعاتو سره هم مطابقت لري ، کوم چې ښودلې چې nsp9 (او nsp8) په جدي او په ځانګړي توګه د محافظت شوي cis-acting RNA عنصر سره د کورونویرس جینوم 3 پای ته نږدې متقابل عمل کوي.۴۵).د دې راپور له مخې، دا پخوانۍ مشاهدې اوس د نورو څیړنو له لارې بیا وڅیړل شي او پراخې شي.

په لنډیز کې، زموږ ډاټا د N-Terminus کې د RdRp سره تړلی د ملکیت نیست شوي ویروس انزایم ټاګ ځانګړی فعالیت مشخص کړ.په کورونویرس کې، دا نوی کشف شوی د NiRAN منځګړیتوب UMPylator/NMPylator فعالیت په Mn2+ او نږدې Asn پاتې شونو تکیه کولو لپاره کارول کیږي او د N-ټرمینل لومړني امین سره د (کم انرژي) فاسفورامیډیټ بانډونو رامینځته کیدو لامل کیږي.په nsp8د nsp12 NiRAN فعال سایټ او د nsp9 هدف کې د کلیدي پاتې شونو ساتنه، د دوو کورونویرسونو څخه ترلاسه شوي معلوماتو سره یوځای د SARS-CoV-2 په شمول، قوي شواهد وړاندې کوي چې nsp9 NMPylation د کورونویرس محافظه کار ځانګړتیاوې هم د ویروس په نقل کې یو مهم ګام دی.موجود معلومات موږ دې نتیجې ته رسوي چې د پروټین هڅول شوي RNA ترکیب کې د NSP9 د NMPylated شکل ځانګړی رول د کورونویرس او نورو ځړول شوي ویروسونو لپاره مناسب سناریو ده ، او NiRAN ممکن نور نامعلوم پروټینونه هم په نښه کړي.ویروس تنظیم کړئ.د کوربه تعامل.که تایید شي، د ویروس RNA ترکیب کې د پروټین پریمرونو ښکیلتیا به د Mpro/3CLpro او RdRp ډومینونو د مخکیني کشف شوي کورونویرس او picornavirus په څیر سوپر ګروپ (9) ترمنځ د ترتیب تړاو زیات کړي، کوم چې اوس په دې وروستیو کې رامینځته شوي Pisonivirites کې متحد شوي (. 46) په کټګورۍ کې.

زموږ معلومات دا هم ښیې چې په دې څیړنه کې پیژندل شوي لومړني، انتخابي او محافظه کار انزایم فعالیتونه د انټي ویرل درملو لپاره د هدفونو په توګه کارول کیدی شي.هغه مرکبات چې د NiRAN په فعال سایټ کې د محافظت شوي nsp9 N-terminus د پابندۍ (او ورپسې تعدیل) سره مداخله کوي په مؤثره او هر اړخیزه انټي ویرل درملو کې رامینځته کیدی شي چې د مختلف (فرعي) جینس انتاناتو څخه د څارویو او انساني کورونویرس درملنې لپاره مناسب دي. د SARS-CoV-2 او د مینځني ختیځ تنفسي سنډروم کورونویرس په شمول.

په دې څیړنه کې تولید شوي د کورونویرس پروټین د کوډ کولو ترتیب د RT-PCR لخوا د RNA په کارولو سره پراخ شوی و چې د HCoV-229E سره اخته شوي Huh-7 څخه جلا شوی یا د SARS-CoV-2 سره اخته شوی Vero E6، او د معیاري کلونینګ پروسیجرونو په کارولو سره داخل شوی.pMAL-c2 (د نوي انګلستان بیولوژیکي لابراتوار) یا PASK3-Ub-CHis6 (47) څرګند ویکتور (SI ضمیمه، جدول S1 او S2).د واحد کوډون بدیلونه د PCR-based site-directed mutagenesis (48) لخوا معرفي شوي.د MBP فیوژن پروټین د تولید لپاره، د E. coli TB1 حجرې د مناسب pMAL-c2 پلاسمیډ جوړښت (SI ضمیمه، جدول S1) سره بدل شوي.د فیوژن پروټین د امیلوز افیونیت کروماتګرافي لخوا پاک شوی او د فاکتور Xa سره پاک شوی.وروسته، د C-ټرمینل His6-tagged پروټین د Ni-immobilized د فلزي تړاو کروماتګرافي (Ni-IMAC) لخوا پاک شو لکه څنګه چې مخکې تشریح شوي (49).د ubiquitin فیوژن پروټین د تولید لپاره، د E. coli TB1 حجرو مناسب pASK3-Ub-CHis6 پلاسمید ساختمان (SI ضمیمه، جدول S1 او S2) او pCGI پلاسمیډ DNA کوډ کولو ubiquitin-ځانګړي C-ټرمینل هایدرولیس 1 (Ubp1) کارول.بدلون (۴۷).د C-terminal His6-tagged کورونویرس پروټین پاک شوی لکه څنګه چې مخکې تشریح شوی (50).

د HCoV-229E nsp12-His6 د ځان NMPylation ازموینه ترسره شوه لکه څنګه چې په EAV nsp9 (16) کې تشریح شوي.په لنډه توګه، nsp12-His6 (0.5 µM) 50 mM 4- (2-hydroxyethyl) - 1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) -KOH، pH 8.0، 5 mM dithiothreitol (DTT)، 6 mM MnCl2، 25Mincbuffer ټاکل شوی NTP او 0.17 µM د 30 دقیقو لپاره په 30 ° C کې [α32-P] NTP (3,000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) سره سمون لري.د nsp12 منځګړیتوب nsp9 NMPylation په نورو ټولو (معیاري) NMPylation ارزونو کې، د عکس العمل شرایط په لاندې ډول تنظیم شوي: nsp12-His6 (0.05 µM) او nsp9-His6 (4 µM) د 50 mM HEPES-KOH (pH08) په شتون کې. )، 5 mM DTT، 1 mM MnCl2، 25 µM ښودل شوي NTP، او 0.17 µM د [α32-P]NTP سره سمون لري.د 10 دقیقو لپاره په 30 درجې سانتي ګراد کې د انفجار کولو وروسته، د عکس العمل نمونه د SDS-PAGE نمونې بفر سره مخلوط شوه: 62.5 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane HCl (pH 6.8)، 100 mM DTT، 2.5٪ SDS، 10٪ ګیلیسرول او 0.005٪ 0.00mophenol. آبي.پروټین د 5 دقیقو لپاره په 90 ° C تودوخه کې له مینځه وړل شوی او د 12٪ SDS-PAGE لخوا جلا شوی.جیل د Coomassie Brilliant Blue محلول (40% methanol, 10% acetic acid, 0.05% Coomassie Brilliant Blue R-250) سره تثبیت شوی او داغ شوی دی، رنګ شوی، او د 20 ساعتونو لپاره د فاسفورسینټ عکس العمل سکرین ته ښکاره شوی (د NMPy څخه nsp12 کشف کولو لپاره) یا ( اعظمي) 2 ساعته (د nsp9 NMPylation ارزولو لپاره).A Typhoon 9200 imager (GE Healthcare) د سکرین سکین کولو لپاره کارول شوی و او ImageJ د سیګنال شدت تحلیل کولو لپاره کارول شوی و.

د MS تحلیل لپاره، 1 µM nsp12-His6 او 10 µM nsp9 (پرته د hexahistidine ټګ) د NMPylation تحلیل (SI ضمیمه، جدول S1) کې کارول شوي او د 500 µM UTP او GTP زیاتوالی غلظت کارول شوی.د دوی د غلظت او متوقع پروټین کیفیت پورې اړه لري، د اوبو ترلاسه کولو H-Class HPLC سیسټم چې د MassPrep کالم (اوبو) سره مجهز دی د 1 څخه تر 10 µL د بفر شوي پروټین محلولونو آنلاین پاکولو لپاره کارول شوي.له مینځه وړل شوی پروټین د Synapt G2Si ماس سپیکٹرومیټر (اوبو) د الیکٹرو سپری آئن سرچینې ته د بفر A (اوبه / 0.05٪ فارمیک اسید) او بفر B (acetonitrile / 0.045٪ فارمیک اسید) د لاندې درجې له لارې ایستل کیږي او د کالم تودوخې درجه ده. 60 ° C او د جریان کچه 0.1 mL/min: د 2 دقیقو لپاره د 5% A سره په جلا توګه جلا کول، بیا په 8 دقیقو کې 95٪ B ته خطي تدریجي، او د نورو 4 دقیقو لپاره 95٪ B ساتل.

مثبت آیونونه د 500 څخه تر 5000 m/z پورې د ډله ایز رینج سره کشف شوي.Glu-fibrinopeptide B په هرو 45 ثانیو کې د اتوماتیک ماس ډریف اصلاح لپاره اندازه کیږي.د MaxEnt1 توسیع سره د MassLynx وسیلې سافټویر وکاروئ ترڅو د بیس لاین کمولو او سمولو وروسته اوسط سپیکٹرم له مینځه ویسي.

UMPylated HCoV-229E nsp9 د ترتیب درجې تعدیل شوي ټریپسین (Serva) په اضافه کولو سره هضم شوی او د شپې په 37 سانتي ګراد کې سینګار شوی.د Chromabond C18WP سپن کالم (برخه شمیره 730522؛ Macherey-Nagel) د پیپټایډونو د مینځلو او متمرکز کولو لپاره کارول کیده.په نهایت کې، پیپټایډ په 25 µL اوبو کې منحل شو چې 5% acetonitrile او 0.1% فارمیک اسید لري.

نمونې د MS لخوا د Orbitrap Velos Pro mass spectrometer (Thermo Scientific) په کارولو سره تحلیل شوي.حتمي نانو HPLC سیسټم (Dionex)، د دودیز پای نصب شوي 50 سانتي مترو سره سمبال شوی؟75 μm C18 RP کالم د 2.4 μm مقناطیسي موتی سره ډک شوی (ډاکټر البین مایچ لوړ فعالیت LC GmbH) د پروکسیون نانو سپری سرچینې له لارې آنلاین ماس سپیکرومیټر سره وصل کړئ؛6 µL د ټریپسین هضم محلول د 300 µm داخلي قطر ×؟؟1 cm C18 PepMap مخکې د غلظت کالم (Thermo Scientific).د محلول په توګه د اوبو/0.05% فارمیک اسید په کارولو سره، نمونه په اوتومات ډول د 6 µL/min د جریان په نرخ کې ګیر او پاکه شوه.

د اوبو لاندې درجې / 0.05٪ فارمیک اسید (سالوینټ A) او 80٪ acetonitrile / 0.045٪ فارمیک اسید (سالوینټ B) د 300 nL/min په جریان کې د ټریپټیک پیپټایډونو جلا کولو ترلاسه کولو لپاره کارول شوي: 4٪ B لپاره 5 دقیقې، بیا 30 دقیقو کې 45٪ B ته خطي تدریجي، او په 5 دقیقو کې د 95٪ محلول B ته خطي زیاتوالی.د کروماتګرافیک کالم د سټینلیس سټیل نانو ایمیټر (Proxeon) سره وصل کړئ ، او د 2,300 V ظرفیت په کارولو سره د ماس سپیکٹرو میټر ګرم شوي کیپیلري ته الیونټ مستقیم سپرې کړئ. د لږ تر لږه درې ډیټا MS/MS سکینونو سره، په متحرک ډول د 30 ثانیو لپاره خارج شوي، د خطي ion trap collision induced dissociation یا د لوړ انرژی د ټکر انډول په کارولو سره د اوربټراپ کشف سره یوځای، ریزولوشن 7,500 دی.